Die russische Kirche auf der Mathildenhöhe wurde vom letzten russischen Zaren Nikolaus II. und der Zarin Alexandra (Prinzessin Alix von Hessen-Darmstadt, Schwester der Hl. Elisabeth Feodorowna) aus Privatmitteln erbaut. Das tief religiöse Herrscherpaar wollte bei seinen Familienbesuchen in Darmstadt nicht auf russisch-orthodoxe Gottesdienste verzichten. Aus diesem Grunde spendete der Zar die Mittel zum Bau der Kirche auf der Mathildenhöhe, die daher Privateigentum der Zarenfamilie war.
Die Kirche wurde als erstes Gebäude auf der Mathildenhöhe errichtet. Erst später entstand das von Großherzog Ernst Ludwig geförderte Jugendstilensemble.
Die Kirche wurde im Stil der frühen Jaroslawer Kirchen erbaut. Sie steht auf russischen Boden, da eigens aus Russland Erdreich nach Darmstadt transportiert worden war, der aus allen Gouvernements stammte. Mit ihren vergoldeten Zwiebelkuppeln und reich mit Ornamenten verzierten sowie vergoldeten Dachfirsten stellt diese Kirche ein Kleinod russischer Kirchenbaukunst in Deutschland dar.
Selbst der zum Bau verwandte Marmor im Sockelbereich stammte aus dem russischen Reich, genauer gesagt, aus dem Kaukasus. Die Baupläne entwarf der Rektor der Petersburger Akademie der Künste, Prof. Benois, der auch die Kirche in Bad Homburg erbaute. Die Kacheln an der Außenfassade und in den Türmen der Zwiebelkuppeln wurden von der Firma Villeroy und Boch speziell für die Kirche angefertigt. Auf den Kacheln wie auch den geschmiedeten Dachfirsten sind stilisierte Zarenadler angebracht. Die Ikonen der Ikonostase wurden von dem bekannten russischen Kirchenmaler Karl Timoleon Neff gemalt.
Für die russische Emigranten ist die Kirche in Darmstadt Gedenk- und Pilgerstätte zugleich: zum Jahrestag der Ermordung der Zarenfamilie (4./17.Juli) wurden früher in der Kirche jährlich eine Panichida (Totenamt) zelebriert, seit der Verherrlichung der Neumärtyrer und Bekenner Russlands im Jahre 1981 wird in der Kirche am Todestag der Zarenfamilie eine bischöfliche Liturgie mit einem Moleben (Bittgottesdienst) zu Ehren der kaiserlichen Neumärtyrer Zar Nikolaus, Zarin Alexandra, Zarewitsch Aleksij und der Zarentöchter Olga, Tatjana, Maria und Anastasija gefeiert. Im Anschluss an diese Feier findet eine Prozession mit der Ikone der Zarenfamilie um die Kirche statt.
Die Grundsteinlegung der Kirche erfolgte am. 16. Oktober (29. Okt.) 1897 (Gedenktag des Hl. Märtyrers Longinos, d. Hauptmanns, der am Kreuze des Herrn stand) in Anwesenheit des russischen Kaiserpaares. Die Kirche wurde am 26. Sept. (9. Okt.) 1899 (am Festtag des Entschlafens des Hl. Apostels Johannes) geweiht. Auch zu diesem Anlass kamen Zar Nikolaus II. und Zarin Alexandra mit der Familie wieder nach Darmstadt.
Die Ikonostase, das Altartuch und die Kirchenfahnen stammten aus der Londoner Privatkirche der Großfürstin Maria Alexandrowna (Tochter Alexanders II.), der Herzogin von Sachsen-Coburg-Gotha. Außerdem wurden aus der Londoner Kirche der aus Eichenholz geschnitzte Sarkophag mit dem Grab Christi (an der rechten Kirchenwand) der Kirche in Darmstadt geschenkt. Das liturgische Gerät wurde eigens für die Kirche geschaffen. Die Ausschmückung der Kirche mit den Mosaiken (in der Apsis des Kircheninneren und an den Außenwänden) war erst im Jahre 1903 beendet.
